Au 13e siècle, un berger découvre une statue de la Vierge au bord de la rivière Guadalupe. Les fidèles de la région l'ont cachée là pour la soustraire au contrôle des Maures. Une chapelle est bientôt bâtie sur les lieux pour abriter la sainte icône. Alphonse XI invoque Santa Maria de Guadalupe à la veille de la bataille de Rio Salado, et le lendemain de son triomphe et en guise de reconnaissance, il fait construire le monastère qui devient un sanctuaire royal.
L'église principale construite par Alphonse XI est rénovée au cours des 14e et 15e siècles. Une chapelle datant du 16e siècle la relie à une sacristie de style baroque où se trouvent des toiles de Zurbaran. Derrière la basilique se trouve la Camarin de la Virgen (« chambre de la Vierge »), un édifice baroque et rococo construit de 1687 à 1696. C'est en fait une grande salle en stuc, décorée par neuf toiles de Luca Giordano. La statue de la Vierge est placée sur un trône royal.
La propriété compte également un cloître de style mudéjar, disposant de deux étages et d'un arc central, un cloître gothique et une église secondaire datant de 1730. Cette dernière est construite à la demande d'un descendant de Christophe Colomb. Dans l'enceinte du monastère se trouve également le musée de la broderie, des sculptures et des peintures.
En 1389, les Hiéronymites font du monastère leur fief central. L'édifice conserve la protection royale jusqu'à la sécularisation des monastères espagnols, en 1835. Les Franciscains s'installent dans le bâtiment à cette époque et le pape La Vierge de Guadalupe est la sainte patronne la plus vénérée du monde hispanophone.
L'élément déclencheur de cette célébration est la grande piété d'Alphonse XI, essentiellement tournée vers la Vierge, envers laquelle il éprouve une véritable adoration.
Le culte grandit en popularité, au fur et à mesure des victoires de la reconquête de Grenade. En effet, les Rois Catholiques attribuent ces succès à la clémence de la Vierge. Cette foi acquiert ainsi une dimension sans précédent, accompagnant les conquistadores en route pour les Amériques. Certains historiens estiment donc que la statue du monastère a été un puissant outil dans l'évangélisation du Nouveau Monde.
Aujourd'hui encore, le monastère est un lieu de pèlerinage fréquenté chaque année par des milliers de fidèles venant du monde entier.
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